試験 メスの2歳齢のビーグル犬において全身麻酔を施した後、通法どおりに髄腔開拡し#60まで根管拡大形成を行い、根管口部に綿球をおき、開放状態で1ヶ月放置して感染させ、その後水硬性セメント（キャビトン：GC）およびコンポジットレジン（クリアフィル マジェスティLV, ノリタケデンタル）にて仮封して、さらに2ヶ月置き、難治性の根尖性歯周炎を作成した（図1A）。その後、仮封を除去しペーパーポイントにて根管内を乾燥し、釣菌を行いプラディア（昭和薬品化工株式会社）にて感染の確認を行った。また、歯科用CT（Veraviewepocs 3D,モリタ）にて根尖病巣の有無を確認した。 次いで6%次亜塩素酸ナトリウムと3%過酸化水素水にてそれぞれ計2 mLずつ交互に洗浄を行い、生理食塩水5 mLにて根管を洗浄した。引き続き、滅菌ペーパーポイントにて根管内を乾燥し、2週ごとにビブラマイシン35 μg/mL（ドキシサイクリン塩酸塩水和物,ファイザー）、ナノバブル99%の薬液を5分間適用し薬剤導入を行った。コントロールとしてはドキシサイクリンのみ注入した。適応後、生理食塩水で洗浄後、ドキシサイクリン溶液を根管内にペーパーポイントにて貼薬し、水硬性セメントとコンポジットレジンを用いて仮封した。2週間後に2回目の釣菌を行った後、同様に適応し、その後根管内に貼薬した。同様の操作を4回目まで行った（図1B）。釣菌したサンプルは段階希釈法にてBHI寒天培地に播種し、2日間嫌気培養後コロニー数を測定した。得られた結果は、統計ソフト（SPSS、IBM、Armonk, USA）にてノンパラメトリック検定を用いて統計処理を行った。3. 釣菌した細菌の各種抗生剤に対する感受性 釣菌した細菌37 ℃にて24時間培養後BHI寒天培地に塗抹して接種した。接種3分後にアンピシリン（5、50、500 μg/mL）、テトラサイクリン（5、50、500 μg/mL）、ドキシサイクリン（10、100、1000 μg/mL）、チゲサイクリン（2.5、25、250 μg/mL）を浸潤させたディスクを配置した。37 ℃にて24時間培養後、阻止円の有無を確認した。4. ドキシサイクリン含有ナノバブルの歯への浸透実験 ブタ新鮮抜去小臼歯（名古屋食肉公社）を#60（Kファイル）まで根管拡大し、3% EDTA（スメアクリーン, 日本歯科薬品）で2分間処理した根管内に、最終濃度5.0 mg/mLのテトラサイクリン（Sigma）と①蒸留水、②ナノバブルのみ、③35 μg/mLドキシサイクリンのみ、および④35 μg/mLドキシサイクリン含有ナノバブルをそれぞれ混合して注入し5分静置した。その後、ゼーゲミクロトーム（SP1600, Leica）にて切片を作製し、蛍光実体顕微鏡（MZFL Ⅲ, Leica）にて象牙細管への薬剤浸透の比較検討を行った。5.ドキシサイクリン含有ナノバブルのスメア層除去 ブタ新鮮抜去小臼歯の根管をKファイルにて#60まで根管拡大形成し、5%次亜塩素酸ナトリウム（関東化学）2 mLおよび3%過酸化水素水（健栄製薬）2 mLにて交互洗浄後、5 mL生理食塩水でさらに洗浄、乾燥した。蒸留水、ナノバブル、35 μg/mLドキシサイクリンおよび35 μg/mLドキシサイクリン含有ナノバブルを各2 mLで５分間、スメア層を洗浄した。適応後、2％グルタールアルデヒドにて12時間固定し、脱水後、白金10 kVにて蒸着した。その後、それぞれの標本を走査電子顕微鏡にて、根管中部を観察した。6. ナノサイト、ゼータサイザーを用いたナノバブルの性状解析 ナノサイト（日本カンタムデザイン）、ゼータサイザー（マルバーン）を用いて、ナノバブルおよび35 μg/mLドキシサイクリン含有ナノバブルの濃度、泡径、ゼータ電位を測定した。7. 統計解析 統計学的解析は統計用解析ソフトSPSS21.0（IBM, Armonk, NY）により、一元配置分散分析、10
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