表1 PCRプライマーGenBankAccession NumberGeneCLCN1NM_000083CLCN2NM_004366CLCN3NM_001243372CLCN4NM_001830CLCN5NM_001127899CLCN6NM_001286CLCN7NM_001287CLCNKANM_004070CLCNKBNM_000085ACTBNM_001101Primer (5' > 3')システム（Roche Diagnostics）を用いて行った。サイバーグリーンアッセイ法を用いて、サイクル毎の蛍光強度を測定し、相対的なmRNA発現量を内在性標準として用いたACTB（β-actin）のmRNA発現量で規格化した。本実験で用いたヒトCLCNファミリーのプライマー配列は、表1に示した。免疫細胞染色法 PASMCsを4% paraformaldehydeで10 min、室温で固定した後、phosphate-buffered saline（PBS）で洗浄した。その後、CLCN2抗体（200倍希釈、ACL-002、Alomone Labs）、0.2% Triton X-100、1% normal goat serumを含有したPBS中で12 hr、4 ºCで処理した。一次抗体溶液を洗浄した後、Alexa Fluor 488 anti-rabbit IgG抗体（1000倍希釈、A11008、Molecular Probes/Invitrogen）で1 hr、室温で処理した。二次抗体溶液を洗浄した後、共焦点蛍光顕微鏡（A1R、Nikon）を用いて蛍光観察した。ホールセルパッチクランプ法 単一PASMCsにホールセルパッチクランプ法を(+) TTG TGT ATC TGC ATC GCC AAG T(-) GTG AAT GAG GCA ATG ACA AAG G(+) GGA ACC GGG ATG AAG AGA CTA TTA(-) CGA AGC CAC TAG CAA TAC CAA TG(+) TGG GAT TTG CCC TCA GAA GA(-) GAG GAC TTT CTG CTG GAA GAG ATG(+) GCG GCA CTG CAG GTG TAA TTA(-) TCC TCA TAC GTC CCC ACA TCA(+) GGA GCC AAT CCC TGG TGT A(-) TAA TCT CTC GGT GCC TAT C(+) GAT ACC CGA GGT CAA ATG CTA TC(-) CAC ACT GAA CAG CAC TCC AA(+) GAT GAT CCA CTC AGG TTC AGT GAT(-) TGT CTC TGC GGA AGT ACT CGA A(+) GTA TCT GCC AGG TGC TCA GTG A(-) AGA CAA CCC CAG AGG GCA TCT(+) TGC CAG CCC TCC TTC TAT GAT(-) CAG TGT GGT GAT GCT GTG GTT(+) AGG CCA ACC GCG AGA AGA TG(-) GCC AGA GGC GTA CAG GGA TA適用し、Cl-チャネル電流を測定した。膜電流測定には、ホールセルパッチクランプ用増幅器（CEZ-2400、Nihon Kohden）、アナログ－デジタル変換器（Digidata 1440A、Axon Instruments/Molecular Devices）、pCLAMPソフトウェア（version 10、Axon Instruments/Molecular Devices）を用いた。PASMCsは、保持電位0 mVから-140〜+100 mVに+20 mV間隔で1 sec刺激した。灌流溶液の組成は、137 mM NaCl、5.9 mM KCl、2.2 mM CaCl2、1.2 mM MgCl2、14 mM glucose、10 mM HEPES（pH 7.4）であった。細胞内液の組成は、62 mM CsCl、58 mM Cs-aspartate、20 mM tetraethylammonium （TEA）-Cl、4 mM MgCl2、2 mM ATPNa2、10 mM HEPES、5 mM EGTA（pH 7.2）であった。実験は室温（23±1 ºC）で行った。統計解析 実験より得られたデータは、平均値±標準誤差（mean±S.E.）で示した。2群間の有意差検定には、Student’s t検定を用いた。図中の*は、p<0.05を有意とした。ProductSize1196-1316(121 bp)1010-1126(117 bp)2532-2660(129 bp)378-486(109 bp)885-979(95 bp)546-645(100 bp)801-901(101 bp)2345-2445(101 bp)1649-1780(132 bp)422-522(101 bp)162
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