方 法結 果IDH2変異急性骨髄性白血病における脂質代謝適応を介した薬剤耐性メカニズム40% であり、半数以上の患者は本薬剤に対して不応である 5,6）。このことは、オンコメタボライト非依存（ATCC）より購入し、10% 血清を添加した RPMI1640いるが、臨床試験の結果ではその奏効率はおよそ性の腫瘍生存・増殖経路の存在を示唆している。また、IDH2 阻害剤は細胞死誘導よりも細胞分化を誘導することにより治療効果を発揮する薬剤であるが、臨床試験の結果から治療後の残存変異陽性細胞の割合と薬剤への反応性は逆相関することが示され 5）、変異陽性細胞に二次的遺伝子変異が加わることにより耐性を獲得した症例も報告されている 7）ことから、本薬剤に加えて細胞死を誘導する薬剤を併用することにより本疾患の予後改善が期待できると考えられる。 本研究では、細胞代謝に着目してこの IDH2変異 AML におけるオンコメタボライト非依存性経路の分子メカニズムを明らかにし、これを標的とすることで変異型 IDH2 阻害剤耐性クローンを駆逐し、結果として IDH2 変異 AML の予後を改善しうる新規治療法を開発することを目的とした。細胞培養 CRISPR/Cas9 により IDH2 遺伝子変異を導入した AML 細胞株 TF-1 およびその親株である IDH野生型 TF-1 細胞は American Type Culture Collection 培地にて培養した。維持培養ではヒト GM-CSF 2 ng/mL を加えて培養したが、薬剤添加実験では細胞をPBS で一度洗浄した後 GM-CSF 不添加培地に置き換えて阻害剤を加え培養し、生細胞数の変化をトリパンブルー染色を用いて評価した。メタボローム解析 上記細胞株を阻害剤添加条件で 10 日間培養した後回収し、細胞内代謝物を抽出後 CE-TOFMS、 CE-QqQMS および GC-MS を用いて分析を行った。得られたデータはウェブベース解析ツールであるMetaboAnalyst （https://www.metaboanalyst.ca/）8）を用いて解析した。薬剤スクリーニング IDH2 遺伝子変異 TF-1 細胞を代謝阻害剤ライブラリに含まれる薬剤存在下に 7 日間培養し、細胞数の変化を DMSO 添加コントロール細胞と比較した。アポトーシス解析 上記細胞株を阻害剤添加条件で 3 ～ 10 日間培養した後回収し、Annexin V および 7-AAD で染色、その陽性率をフローサイトメトリーを用いて測定した。RNA シークエンス解析 上記細胞株を阻害剤添加条件で 10 日間培養した後回収、RNeasy Mini Kit（Qiagen）を用いて RNA を抽出し、ライブラリ調製後 NextSeq 500（Illumina） を使用してシーケンスした。得られたシーケンスデータは CLC Genomics Workbench（Qiagen）を用いてマッピングし、定量化した。Gene Ontology （GO） 解 析 は ウ ェ ブ ベ ー ス 解 析 ツ ー ル で あ るDAVID（https://david.ncifcrf.gov/home.jsp）9,10）を用いて行った。統計解析 2 群間の比較は t 検定により行った。p<0.05 を有意差ありとした。変異 IDH2 阻害剤耐性 AML 細胞モデル サイトカイン依存性 AML 細胞株である TF-1 を親株とする IDH2 遺伝子変異 TF-1 細胞は、GM-CSF添加条件下では IDH2 野生株と同様の増殖を示したが、サイトカイン非添加条件下では、IDH2 野生株が増殖を停止したのに対し IDH2 変異株はサイトカイン非依存性増殖を示した。この IDH2 変異株を変異 IDH2 阻害剤存在下に培養したところ、細胞増殖は抑えられたが、IDH2 野生株と比較すると有意に高い増殖性を示し、変異型 IDH2 阻害剤に対し125
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