P(01goL-P(01goL-040202-04-A) .0B)64200C)642022%631( 2tnenopmoC8Log 2 (Fold Change)8Log 2 (Fold Change)結 果図1 BCRP阻害剤lapatinibを経口投与したマウスの血漿サンプルを用いたBCRP基質スクリーニング（A）2週間きな粉を混餌投与した野生型マウスにvehicleまたはlapatinib （30、90 mg/kg）を経口投与後の血漿サンプルのアンターゲットメタボロミクス解析で得られたピーク強度のPLS-DAスコアプロット。検出された全てのピーク（B）またはall-ion fragmentation解析後にneutral loss 79.96 ± 0.01 Daを有したピーク（C）のボルケーノプロット。赤丸は、lapatinib高投与群で有意（p < 0.05）かつ2倍以上に強度が高くなったイオンを、黒丸はその他の検出されたイオンを示す（B、C）。で3時間の超遠心の沈殿画分を膜小胞画分として採取した。輸送実験は、15 µLの反応バッファー（250 mM sucrose、10 mM Tris-HCl、10 mM MgCl2、10 mM creatinine phosphate、100 µg/mL creatinine kinase、pH 7.4）を4 mM ATPまたはAMP存在下で、被検化合物（DSまたはES（3 µM）、LY（10 µM））と37 ℃5分間プレインキュベーションした。反応バッファーを、膜小胞懸濁液（5 µg protein）と各種濃度のBCRP阻害剤（Ko143、lapatinib、febuxostat）と混合して、反応を開始した。37 ℃5分間の反応後、氷冷した50 µLの反応停止バッファー（250 mM sucrose、100 mM NaCl、10 mM Tris-HCl、pH 7.4）と混合後、Sephadex G-50 Fine （Cytiva、Marlborough、MA）をパックしたスピンカラムにアプライし、760×gで2分間遠心し、溶出液を回収した。溶出液中のLYは、マルチモードプレートリーダーで、DSおよびESは、LC-MS/MSで測定した。LC-MS/MSによる測定 血漿サンプルは、12.5倍容量のメタノールと混合後、26,418×gで2分間遠心した上清を、LCMS-8040（島津製作所、京都）にインジェクションして測定した。測定は、負イオンモードのエレクトロスプレーイオン化法によるMRMモード（sulfasalazine: 397.0>197.1、DS: 331.1>253.0、ES: 321.2>241.1）で行った。統計解析 統計解析は、Studentのt検定、一元配置分散分析とDunnett法、二元配置分散分析とTukey-Kramer法をGraphPad Prism 7（GraphPad Software、San Diego、CA）を用いて実施した。BCRP阻害剤を投与後のマウス血漿におけるBCRP生体内基質の探索 マウス血漿サンプルのアンターゲットメタボロミクス測定の結果、1,272個のピークが検出され、これらの部分的最小二乗判別分析（PLS-DA）では、vehicle、lapatinib低投与量（30 mg/kg）と高投与量（90 mg/kg）の3群は良好に分離された（図1A）。このうちvehicleとlapatinib高投与量群に着目すると、135個のピークはlapatinib高投与群で有意（p < 0.05）かつ2倍以上に強度が高くなった（図1B）。一方、これらのイオンのMSスペクトルの多くは、M+2の同位体ピークを有しており、これは塩素原子の同位体パターン（35Cl：37Cl = 3：1）と対応した。Lapatinibは分子内に塩素原子を有し、これらの着目したイオンの多くは、lapatinibまたはその代謝物に由来するparentまたはfragmentイオンであるVehicleLapatinib (30 mg/kg)Lapatinib (90 mg/kg)2015040-20Component 1 (27 %)-4-20Lapatinib (90 mg/kg) / Vehicle-4-2046Lapatinib (90 mg/kg) / Vehicle46LapatinibSulfasalazineDS
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