1.0105cells/insert5.0105cells/insert20 μmμ20 m結 果モデルをPBSで洗浄した後、4%パラホルムアルデヒドで固定し、0.2%Triton X-100で浸透処理した。洗浄後、TUNEL反応混合物を加えて標識し、さらにPBSで洗浄後、SYTOX Greenを用いて核を染色した。サンプルをC2+共焦点レーザー顕微鏡で観察し、ImageJを用いて、ランダムに選んだ4つの視野について、全核面積に対するTUNEL陽性細胞核の面積比を算出した。定量的PCR法（RT-qPCR） 細胞播種72時間後に、3D培養モデルからtotal RNAを抽出した。THUNDERBIRD SYBR qPCR mix（TOYOBO）を用いて、StepOne PlusリアルタイムPCRシステム（Applied Biosystems）でRT-qPCRと解析を行った。使用したプライマーは以下のとおりである。[CCND1（Forward: 5’-AATGAAGCCAGCTCACAGTG-3’、Reverse: 5’-GCGGGGTGCAAATTCTTTTG-3’）、ACTB （Forward: 5’-TCACCCACACTGTGCCCATCTACGA -3’、Reverse: 5’-CAGCGGAACCGCTCATTGCCAATGG -3’）]統計解析 データは平均値±標準偏差で示した。統計解析は、GraphPad Prism 8（GraphPad Software, Inc.）図2 PAH肺動脈中膜3D培養モデルの厚みの変化播種細胞数を変化させることにより、3D培養モデルの厚みの調節が可能となった。上図 3D培養モデルのヘマトキシリン・エオジン染色。スケールバー=20 μm。下図 PASMCの核（SYTOX Green;緑）を染色した3D培養モデルの3D画像。スケールバー=50 μm。を用いて行った。2群間の比較はWelch補正したUnpaired Student's t-testで行い、3群以上の比較は、一元配置分散分析後、Dunnettの多重比較検定を行った。p < 0.05を統計的有意性ありと判定した。3D培養モデルの作製 既報の3D細胞培養法10）を用いて、肺動脈中膜肥厚のin vitroでの再現を試みた。24ウェルの細胞培養インサートにPAH患者由来PASMCを播種した。1インサートあたり1.0×105個の細胞を播種すると、厚さ5‐10μmのPASMCが2‐3層重なった構造体が形成され、播種細胞数を増して5.0×105個とすると、厚さ20‐30μmのPASMCが4‐6層積層した3D構造体が構築できた（図2）。PDGF-BBによる3D培養モデルの肥厚 PDGF-BBは、PASMCの強力な増殖促進因子であり、PAH患者血清中で高値を示す。また、PAH患者由来PASMCにおけるPDGF受容体の発現が上昇していることが判明し6）、PDGFシグナルの活性化亢進がPAHの病因および病態進行において重要な役割を果たす証拠が蓄積されつつある6,8）。そこで我々は、3D培養モデルにPDGF-BBを162
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