がんの浸潤が粘膜にとどまるため、腫瘍内と腫瘍辺縁部の判別が難しいpT1aの症例（N=17）は、解析の対象から外すこととした。H&E染色スライド上で、腫瘍内、腫瘍辺縁部それぞれにおいて、リンパ球が多く集積している場所（hot spot）を3つずつ選び、CD8染色スライド上に同じ場所をマーキングした。リンパ濾胞であると明らかに判断できる場所は、hot spotから除外した。CD8染色スライド上にマーキングした6つのhot spotをDP73デジタルカラーカメラ（Olympus）で撮影し、ImageJ softwareを使ってCD8＋細胞の数を測定した。解析には、腫瘍内または腫瘍辺縁部hot spot 3点のCD8＋細胞平均値を使用した。この際、薄切不良のため（N=11）、または組織が小さすぎるもしくは大きすぎるため（N=6）、正しく数を測定することができない症例が除外され、腫瘍内および腫瘍辺縁部共にCD8＋細胞を測定した症例は329症例（90.6%）であった。 前述のMSI-PCR assayによりMSI-HまたはMSI-Lと判定された症例のみ、mismatch repair（MMR）タンパク質の免疫染色を、実臨床と同じ方法で行った。すなわち、4つのマーカーに対して、それぞれ一次抗体として、MLH1（clone ES05、100倍希釈、Leica Biosystems）、PMS2（clone A16-4、100倍希釈、Leica Bioscience）、MSH2（clone G219-1129、500倍希釈、BD Bioscience、San Jose、CA）およびMSH6（clone EPR3945、500倍希釈、D Bioscience）を使用した。免疫染色の評価は、10%以上の細胞で発現が欠損している場合を「核内MMRタンパク質の発現欠損」とし、発現が保たれている、もしくは欠損している細胞が10%より少ない場合を「核内MMRタンパク質の発現あり」として、2つへ分類することとした。CpGアイランドおよびLINE-1のメチル化解析 CpGアイランド プロモーター領域のメチル化レベルを、MethyLight real-time PCRにより定量した。これまで胃腺癌および大腸腺癌で報告をされた11か所（MLH1、CDKN2A、MGMT、CHFR、CDH1、IGF2、RUNX3、CRABP1、NEUROG1、CACNA1GおよびSOCS1）のCpGプロモーターを対象とし、プライマーおよびプローブも報告されているものと同じ配列を使用することとした12,13）。DNAのバイサルファイト処理はEpiTect Plus DNA Bisulfite Kit（QIAGEN）を、またメチル化のスタンダードとして、Universal Methylated Human DNA Standard（Zymo research、Irvina、CA）を使用した。本研究ではメチル化レベルとして、percentage of the methylated reference（PMR）値を算出することとした。ノーマライゼーションにcollagen 2A1（COL2A1）遺伝子を使用して、前述の各CpGアイランドプロモーターをGENE Xとすると、メチル化スタンダードでのGENE X: COL2A1に対する各サンプルのGENE X: COL2A1の比をPMRとして、PMRが4以上の場合を、「メチル化陽性」とした13）。 LINE-1のメチル化は、pyrosequenceにより測定することとした。前述した方法で各サンプルにバイサルファイト処理を施し、PyroMark Q96 CpG LINE-1（QIAGEN）を使用してLINE-1の305-331のCpGサイト（GenBank accession number X58075）をPCR増幅させた。増幅後、PyroMark Gold Q96（QIAGEN）のマニュアルに従いシークエンスサンプルを調整し、PyroMak Q96-CpGソフト（QIAGEN）によりメチル化シトシンの割合を算出した。全体のメチル化の割合として、4つのCpGサイトの平均値を使用した。TP53シークエンス TP53のシークエンス解読は、前述の方法にて抽出したDNAを鋳型として、HiSeq2500またはMiSeq（Illumina、San Diego、CA）を使用して行った。DNA量が700μg以上ある症例（N=169）は、Novogene laboratory（Beijing、China）へ解読を依頼した。Novogene laboratoryでのHiSeq2500のカバレージ中央値は、24,598リードであった。バリアントの検出は、Haplotype Caller, UnifiedGenotyperおよびVarScanの3つのソフトを使用し、3つのソフトで検出された場合は、そのバリアントを採用4545
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