方 法のリン酸化が、SMURF2のE3ユビキチンリガーゼ活性を活性化することで、SMADシグナルによる間葉系幹細胞（Mesenchymal stem cells, MSC）の幹細胞性維持に重要な役割を果たしていることを見出した5）。さらにSMURF2は、がんの発症・進展を抑制する一方で6）、がんの悪性化進展や予後不良にも関与することから7）、がんにおいても重要な役割を担うことが知られている。しかし、その詳細なメカニズムは明らかとなっておらず、「SMURF2を標的とした抗がん剤」は未だ開発されていない。 TGF-βシグナルはSMAD-SOX4-SOX2経路やSMAD-LIF-JAK-STAT経路を介してGSCの幹細胞性と腫瘍形成性の維持に重要な役割を果たしている8）。GBMにおいて、TGF-βシグナルの活性化に続く腫瘍形成は、SMURF2とUbiquitin-specific peptidase 15（USP15）の活性バランスにより決定する。しかし、in vitro解析、in vivo解析のどちらにおいても、GSCの幹細胞性とグリオーマの病態におけるSMURF2の役割は明らかとなっていない。 そこで本研究では、MSCで得られた著者らの研究成果を基盤とし、GBMに焦点を絞り、「がん幹細胞におけるSMURF2とSMURF2Thr249のリン酸化状態」が、「がん幹細胞の幹細胞性維持機構や、がんの進展制御機構に与える影響」について検討した。細胞株と細胞培養 ヒト胎児腎細胞由来細胞（HEK293T）は理化学研究所バイオリソース研究センター（RIKEN BRC）から入手した。HEK293Tは10 %ウシ胎児血清（FBS）を加えたD-MEM（Hi-Glucose）（FUJIFILM Wako Pure Chemical）で培養した。ヒト患者由来GSC（TGS-01）は、GBM患者の腫瘍組織から単離された。TGS-01はGlutaMAX（Gibco）、B27 supplement minus vitamin A（Gibco）、20 ng/mLヒト組換え上皮細胞成長因子（EGF）（FUJIFILM Wako Pure Chemical）、20 ng/mLヒト組換え線維芽細胞成長因子（FGF）（FUJIFILM Wako Pure Chemical）を加えたDMEM/F12（FUJIFILM Wako Pure Chemical）を含むニューロスフィア培地で培養した。また、分化培地として10% FBSを加えたDMEMを含む接着培養培地を使用し7日間培養した。病理検体 金沢大学病院にて腫瘍の外科的切除を行った患者から合計46の原発性グリオーマ組織を入手した。病理検体はWHO分類に基づいて分類した。非腫瘍性の正常脳組織は腫瘍に隣接する組織から入手した。すべての実験は厚生労働大臣認定 金沢大学臨床研究審査委員会（No.2509）に承認され、すべての患者はインフォームドコンセントを記載し提出した。また、ヒト検体とプロトコルは、岐阜薬科大学、金沢大学の生命倫理委員会により承認された。ウェスタンブロッティング プロテアーゼインヒビターカクテルを加えた溶解バッファー（10 mM Tris-HCl、150 mM NaCl、0.5 mM EDTA、10 mM NaF、1% Nonidet P-40、pH 7.4）で細胞を可溶化し、SDS-PAGEを実施後、PVDFメンブレンに転写し、抗体と反応させバンドを検出した。 以下の一次抗体をブロッキング溶液（5%スキムミルク）で希釈し使用した。 anti-p-Smurf2Thr249（1:2000）（GenScript）、anti-Phospho-Smad2（Ser465/4671）（1:1000）、anti-Smad2（1:1000）、anti-TGF-β ReceptorⅠ（1:1000）、anti- TGF-β ReceptorⅡ（1:1000）、anti-Sox2（1:1000）、anti-p-Smad1（Ser463/465）/5（Ser463/465）/9（Ser465/467）（1:1000）、anti-Smad1（1:1000）、anti-BMPR2（1:1000）、anti-Ubiquitin（1:1000）（Cell Signaling Technologies）、anti-β-actin（1:2000）（Santa Cruz Biotechnology）、anti-Sox4（1:1000） （EMD Millipore）、anti-BMPR1A（1:1000）、anti-SMURF2（1:1000）（Abcam） ChemiDoc Touch Imaging System（Bio-Rad）を59
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