の承認（M2000-979）を得ている。RA-FLSにおける細胞増殖アッセイとサイトカイン産生測定 RA-FLSを0.5% FBS/DMEMに懸濁し、96-wel1 flat bottom plateにl×104cells/wellで播種した。翌日に、化合物の溶媒であるDMSO、UCT、誘導体を加え、3時間の前培養を行い、1 ng/mL TNFαを加えて刺激した。TNFα添加24時間後に上清を回収した。回収後のRA-FLSに水溶性テトラゾリウム塩（WST-8）を加え、2-4時間培養した後に、水溶性ホルマザンの450 nm波長を蛍光プレートリーダーで測定した。誘導体のうち、INH #3D-#3Gを用いたものはCalcein、AM（Invitrogen）を2 μM加え、30分間培養後に520 nm波長をマルチプレートリーダーで測定した。回収した上清を用いてIL-6、CXCL8をELISA（R&D Systems）で測定した。THP-1における細胞増殖アッセイとサイトカイン測定 THP-1を10% FBS/RPMI-1640で懸濁し、96- well round bottom plate に1×106cells/wellで播種した。DMSO、UTCおよびINH #1を加え、3時間で前培養を行い、1 μg/mL LPS（O111、Sigma-Aldrich）で刺激した。LPS添加24時間後に、plateを1500 rpmで5分遠心後、上清を回収した。回収後のTHP-1にWST-8を加え、2-4時間培養後、水溶性ホルマザンの450 nm波長を蛍光プレートリーダーで測定した。回収した上清を用いてIL-6、CXCL8をELISAで測定した。THP-1におけてNF-κB関連分子の発現検討 THP-1を10% FBS/RPMI-1640で懸濁し96-well plateに5×105cellで播種した。DMSO、UTC、INH #1を加え、3時間前培養を行い、10 ng/mL LPSで刺激した。24時間後、細胞を回収し、PBSで2回洗浄した後、2% SDS溶解バッファーで溶解した。細胞溶解液はSDS-PAGEで展開し、PVDF膜へ転写した。その後5％BSA/TBSTでブロッキングを行い、1次抗体を5％BSA/TBSTで希釈して4 ℃で翌日まで培養し、2次抗体を5％BSA/TBSTで希釈して室温で1時間培養後、ECLTM Prime（Amersham）で発色し、LAS-1000（FUJI FILM）にて画像を取得した。抗体は以下の物を用いた；Phospho-NF-κB（Ser536）（93H1）#3033（CST）、NF-κB p65 antibody:sc-8008（Santa Cruz Biotechnology）、IκBα（L35A5）#4814（CST）、IRAK-M Antibody #4369（CST）、Phospho-c-Jun（Ser63）（54B3）#2361、c-Jun（60A8）#9165、A20/TNFAIP（D13H3）#5630（CST）、Anti-rabbit IgG、HRP-linked Antibody #7074（CST）、Anti-mouse IgG、HRP-linked Antibody #7076（CST）。化合物のマウスへの投与 生体投与時には、INH #1は0.9% NaCLで希釈した20% Sulfobutylether-β-Cyclodextrin（フナコシ）へ溶解した。DMSO、DEX、UTC、INH #3はPBSへ溶解した。Sulfobutylether-β-Cyclodextrinが炎症抑制作用を有さないことは予備検討で検証した。化合物のLPS誘導性TNFα産生モデルへの投与 6週齢のC57BL/6J雌マウス（オリエンタル酵母）に対して、DMSO、UTC、DEX、INH #1とINH #3をそれぞれ腹腔内投与（IP）後、1時間後にLPS 100 μg/kgとD-(+)-Galactosamine Hydrochloride（東京化成工業）600 μg/kgをIPした。その1.5時間後に血清を回収し、TNFαをELISA（BD Biosciences）で測定した。化合物のコラーゲン誘導関節炎モデルマウス（CIA）への投与 4週から6週齢のDBA/1J雄マウス（日本クレア） を用いた。ウシ由来Ⅱ型コラーゲン（CⅡ）（コラーゲン技術研修会）を0.05 M酢酸に4 mg/mLとなるように溶解し、完全フロイントアジュバント（CFA）（日本ベクトン・ディッキンソン）または完全型アジュバント（IFA）（日本ベクトン・ディッキンソン）と1:1で混和させて、エマルジョンを作成した。Day 1に1313
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