ABCD対照群タクロリムス群病理学的解析 腎臓サンプルは、4%パラホルムアルデヒド（ナカライテスク）で固定後、パラフィン包埋した。パラフィン包埋下組織は5 μm厚のスライスに切り出しを行った後、マッソン・トリクローム染色を行った。メタボローム解析 凍結保存したマウス腎臓試料は50％アセトニトリル水溶液を破砕用チューブに加え、冷却下にて破砕機を用いて破砕（1,500 rpm、120秒×3回）し、さらに同量の50％アセトニトリル水溶液を加えた。組織破砕後、遠心（2,300×g、4 ℃、5分）を行った。遠心後、上澄みを限外ろ過チューブ（ウルトラフリーMC、PLHCC、HMT、遠心式フィルターユニット 5 kDA）に移し取った。これを遠心（9,100×g、4 ℃、120分）し、限外ろ過処理を行った。ろ液を乾固させ、再びMilli-Q水に溶解して測定に供した。キャピラリー電気泳動・フーリエ変換型質量分析計図2 マッソン・トリクローム染色による腎組織線維化評価マウスの腎組織に対するマッソン・トリクローム染色の結果を示す。（A）と（B）は対照群の病理所見を示し、（C）と（D）はタクロリムス群の病理所見を示す。（B）は（A）内の四角に囲まれた部分を拡大した図であり、（D）は（C）の拡大図である。（D）内の矢印は線維化した部位を示す。（（A）、（C）：スケールバー = 500 μm、（B）、（D）： スケールバー = 100 μm）。（CE-FTMS）で検出されたピークは、自動積分ソフトウェアのMasterHands ver.2.19.0.2を用いて抽出し、質量電荷比（m/z）、ピーク面積値、泳動時間（Migration time: MT）を得た。得られたピークは、次の式を用いて相対面積値に変換した。：相対面積値= 目的ピークの面積値/内部標準物質 の面積値×試料量。 階層的クラスタリンング解析とヒートマップ表記で用いた各サンプルのZスコアは次の式で算出した。：Zスコア= （各サンプル値（x）−代謝物の測定 平均値（μ））/各代謝物の標準偏差（δ）。Quantitative PCR （qPCR） まず、RNeasy® Mini kit（QIAGEN®）を用いて、凍結保存した腎臓組織から製品プロトコールに従ってトータルRNAを抽出した。次にトータルRNAをRevertra Ace® qPCR RT Master Mix with gDNA Remover（TOYOBO）を用いてcDNAに変換127127
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